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[饲料] 陆文清:以纯麦麸为底物检测饲料用非淀粉多糖酶效价的方法【完整版】

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发表于 2019-3-22 10:21:53 | 只看该作者 |只看大图 回帖奖励 |倒序浏览 |阅读模式


农业部饲料工业中心  陆文清 副研究员

陆文清 ,1997 年毕业于无锡轻工大学生物工程学院,获博士学位。1998~2000 任辽宁省饲料研究所所长助理,2000~2002 在中国农业大学做博士后研究,现任农业部饲料工业中心副研究员。多年来,一直从事微生物发酵技术在畜牧生产中的应用研究。作为技术负责人,主持了可移动式微生物厌氧发酵饲料的研究和推广工作,目前该项技术已经在国内 30 多家饲料生产企业推广应用,为生猪的健康养殖提供了很好的技术支持。

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前言

饲料用非淀粉多糖酶是目前饲料工业中应用最广的饲料酶,主要包括木聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶和甘露聚糖酶,它们少部分以单体酶形式使用,大部分以复合酶形式使用。在我国,非淀粉多糖酶占饲料酶市场总量的 65% 左右。在欧洲和北美,非淀粉多糖酶占饲料酶市场总量的 70% 左右。

对于非淀粉多糖酶的分析测定,无论是单体酶还是复合酶,都很繁琐,而且分析数据的实用性和重复性也不理想。目前,实验室的分析底物都是纯度比较高而且易溶于水的聚合物,但是它们实际的天然底物都是不溶于水的聚合物,而且这些聚合物往往相互交联在一起,组成成分也比较复杂。非淀粉多糖酶对天然底物的降解效率很差,往往只有可溶性底物的 5%~10% 左右,而且很难准确定量。动物饲养试验虽然直观,可靠性也比较好,但是试验周期太长(至少需要 2 个月),成本也很高,在实际生产过程中很难推广,与科研过程中要求的快速分析相差甚远。

本文提供的快速检验饲料用非淀粉多糖酶效价的方法,以消除淀粉的麦麸为分析底物,在设定的温度和溶液中加入需要分析的饲料用非淀粉多糖酶。这种饲料酶可以是单体酶,也可以是复合酶。经过设定的反应时间以后,经过滤洗涤、干燥,测定残留底物的干重,计算降解效率,以此作为评价比较所分析酶效价的主要指标。这种试验方法不仅可以快速检测单酶在实验室配制缓冲液中的效价,也可以快速检测复合酶在实验室配制的缓冲液中的效价。不仅可以快速检测单酶在动物消化液中的效价,也可以快速检测复合酶在动物消化液中的效价。

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无淀粉麦麸的制备

1、原麦麸预处理

麦麸是一种很典型的非淀粉多糖复合物和理想的试验用底物。但是常规的饲料用麦麸中含有大量的淀粉残余物不仅会影响测定结果的准确性,而且还有黏性,对测定过程中涉及的分离、过滤、干燥等操作都有很不利的影响。为了确保试验结果的准确性和重复性,需要消除麦麸中的残留淀粉,获得比较纯净的非淀粉多糖复合物。

称取 10kg 普通商品麦麸,用 60kg 清水在常温(20~30℃)浸泡 24h,清洗其中的泥渣和其他可溶性杂物,撇除漂浮的皮壳和麦秸等粗纤维。用清水反复清洗3 次,然后再过滤、挤压,获得洁净的麦麸,其含水量为 65%,总重量为 25kg。将所得麦麸分批平摊在托盘上,挑除其中未破碎的麦粒。这部分未破碎的麦粒虽然很少,但是对后期试验结果的精度有影响,所以必须剔除。

2、酶解麦麸残余淀粉

在容量为 100L 的不锈钢容器中,加入上述获得的清洁麦麸,再加入 45kg 蒸馏水,然后通蒸汽加热升温至 98℃,保持 12min,充分糊化麦麸中残留的淀粉。然后冷却至 65℃,加入 10gα- 淀粉酶(酶活为 4 000u/g),保持 30min。然后逐步加热至 95℃,再加入 20g 糖化酶(酶活为 80 000u/g),保温 60min,以充分糖化残留的淀粉使其成为溶解于水的葡糖糖和麦芽糖。自然冷却至室温,过滤,挤压,获得滤渣,再用蒸馏水清洗滤渣 3 次,以充分滤除残留的葡萄糖和麦芽糖,获得纯净的麦麸,其含水量为 65%,重量为 22kg。

3、气流干燥纯麦麸

把含水量为 65% 的麦麸分批平摊在托盘上进行常温气流干燥,24h 以后基本达到恒重,得到纯麦麸 7.6kg,含水量为 8.0%,残余淀粉含量不超过 0.01%,分装在密封在容器中,于 4℃冰箱中保存。

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酶活效价的测定

1、纯缓冲液中酶活的效价测定

取 12 个 500mL 的三角瓶,在每个三角瓶中加入 250mL 缓冲液(pH 为 5.5,在 5 000mL 蒸馏水中加入 4.5mL 冰醋酸和34.85g 无水醋酸钠,彻底溶解,醋酸根离子的浓度为 0.1mol/L),接着再各加入 10g 制备所得的纯麦麸,在 37℃恒温放置在水浴中,然后在这 12 个三角瓶中加入等量的待分析饲料酶 A。每隔 30min抽取 1 个三角瓶,用 8 层医用纱布进行过滤,时间不超过 2min。过滤结束后,用 250mL 蒸馏水清洗,3 次过后取过滤渣,平摊在不锈钢托盘上,80℃气流干燥8h 至恒重,再常温冷却 2h,然后称重,根据所得降解效率评价饲料酶 A 的效价,测定结果参见图 1。

麦麸的降解率:被降解的麦麸与起始麦麸的重量之比。



随着浸泡酶解时间的增加,纯麦麸中干物质的降解率也在增加,但是降解速度在不断减弱。经过 6h 的酶解,纯麦麸干物质的降解率达到 14.2%。

2、猪胃液中酶活的效价测定

取 3 个饲料用非淀粉多糖酶样品,分别标记为:A、B 和 C。采用纯麦麸降解法比较效价。

在屠宰场收集 10 个猪胃(生猪的体重在95~130kg 之间),取它们的内容物,混合均匀。然后用纱布过滤,获得过滤液。

取3个500mL的三角瓶,分别放入A、B和C饲料用非淀粉多糖酶样品各0.1g,再分别加入 250mL 猪胃过滤液,在 37℃恒温水浴 2min,使酶蛋白充分溶解。然后同时加入 10g 纯麦麸(制备参见上述方法)。60min 以后,同时进行过滤,洗涤。取过滤渣,在常温下气流干燥 12h 至恒重,比较干重,按照如下公式计算得到降解效率,根据所得降解效率评价标记分别为 A、B 和 C 的 3 个非淀粉多糖酶样品的效价所得结果参见表 1。



由表1可知,在上述3种非淀粉多糖酶中,C酶的功效最显著。在测定过程中,不需要进行复杂的酶学分析就可以获得直观的对比结果。而且上述方法已经综合了胃液中多种成分对酶蛋白活性的影响。

3、猪肠液中酶活的效价测定

待分析样品为非淀粉多糖酶 X、Y 和 Z,均为粉状。

在屠宰场收集 10 副猪小肠(生猪的体重在 95~130kg 之间),取其内容物,混合均匀。用纱布包埋过滤、挤压,获得 3L 过滤液。把过滤液存放在 1 个大玻璃瓶中,在 4℃冰箱中存放 24h,取上清液作为饲料酶的溶剂。取 3 个 500mL 的三角瓶,分别加入 X、Y 和 Z  3 种饲料酶样品各 0.1g。再分别加入 250mL 猪小肠上清液,在 37℃水浴保温 5min,使酶蛋白充分溶解。

然后依次在 X、Y 和 Z  3 个酶样溶液中分别加入 10g 纯麦麸,在 37℃水浴保温60min。

同时准备 3 个平行漏斗,配置同样的纱布(重量、层数和叠放方式都一致)。水浴保温结束以后,依次取出 X、Y 和 Z  3 个处理液(酶解时间间隔尽可能与加入麦麸的时间间隔一致),分别进行过滤、洗涤(重复 3 次,用蒸馏水)、挤压和气流干燥(所有的操作方式都一致)。最后,对获得的干燥物进行称量,按照如下公式计算得到降解效率,根据所得降解效率评价标记分别为 X、Y 和 Z 的 3个饲料酶样品的效价。所得结果参见表 2。



由表 2 可知,比较上述 3 种非淀粉多糖酶,在猪肠液中,样品酶 Y 的降解效果最好。

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结论

该方法直观、简便,不需要很精密的分析仪器,而且能同时检验动物消化道的环境对酶蛋白作用效果的影响,从而能更客观全面地反映这些饲料酶的实际效价。饲料生产企业和养殖户可以参照上述方法对非淀粉多糖酶的效价进行分析和比较,适用于饲料用非淀粉多糖酶的研究、生产和应用,特别适用于畜禽和水产饲料中非淀粉多糖酶效价的快速检测。

原创: 陆文清     来源:康普利德
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